Ten Rzymianin, z rodu Julia, był 23. papieżem Kościoła, którym władał w latach 254–257. Wcześniej, jako archidiakon rzymski, opiekował się ubogimi oraz odwiedzał w więzieniu prześladowanych chrześcijan. Czynił to z takim oddaniem, że papież Lucjusz I przed męczeńską śmiercią wyraził życzenie, aby to on został jego następcą.
12 maja 254 r. – po dwumiesięcznym wakacie na Stolicy Piotrowej – rozpoczął się pontyfikat Stefana I. A został on naznaczony sporem o stosunek wobec „upadłych”, czyli chrześcijan, którzy w okresie prześladowań dopuścili się odstępstwa od wiary: czy – nawet na łożu śmierci – odmawiać im rozgrzeszenia, czy traktować ich jako pokutników? Kontrowersje budziła również ocena ważności chrztu apostatów i heretyków; rozstrzygnął ją dopiero w wieku V św. Augustyn, podejmując polemikę z donatystami, sektą chrześcijańską głoszącą, że sakramenty udzielane przez grzesznych szafarzy są nieważne. W czasach Stefana I spór koncentrował się na tym, czy osoby przechodzące na katolicyzm uznawać za już ochrzczone, czy nie. Sytuacja była szczególna, bowiem zwyczaj rzymski wykluczał powtórny chrzest. Wskutek tego doszło do – niebezpiecznej dla jedności Kościoła – polemiki pomiędzy papieżem a Cyprianem. Ów wpływowy biskup Kartaginy uważał, że chrzest heretycki jest nieważny, bo niegodny szafarz nie może przekazać innym Ducha Świętego, skoro sam go nie posiada. Stefan I był przeciwnego zdania i głosił, że szafarz sakramentu jest jedynie narzędziem działania Ducha Świętego. Kiedy dwa synody kartagińskie – w 255 i 256 r. – opowiedziały się za powtórnym chrztem, papież napisał do Cypriana list, w którym zakazał tej praktyki i powołał się na przysługujący mu prymat biskupa Rzymu. Urażony Cyprian wyraził ubolewanie nad „wyniosłymi i nienależącymi do sprawy” wywodami papieża, co groziło kolejną schizmą, bo Cyprian cieszył się wielkim autorytetem. Z misją mediacyjną wystąpił wtedy Dionizy, biskup Aleksandrii, który sam był przeciwnikiem ponownego chrztu i chciał zapobiec rozłamowi pomiędzy Rzymem a Kościołami Afryki i Azji Mniejszej. Po stuleciach teologowie rozstrzygnęli definitywnie, że sakramenty są ważne „ex opere”, czyli własną mocą, a nie „ex opere operantis”, czyli dzięki godności szafarza, który ich udziela. Inaczej mówiąc: o ważności sakramentów decyduje świętość Kościoła, a nie osobista świętość szafarza.
Przez długie lata uważano, że Stefan I poniósł w 257 r. męczeństwo, ścięty podczas nabożeństwa odprawianego w katakumbach, jednak prawdopodobnie zmarł śmiercią naturalną.